بررسی ايمنی زايی ژن های L7L12 و P39 در موش های Balac

بررسی ايمنی زايی ژن های L7L12 و P39 در موش های Balac
بررسی ايمنی زايی ژن های L7L12 و P39 در موش های Balac
60,000 ریال 
تخفیف 15 تا 30 درصدی برای همکاران، کافی نت ها و مشتریان ویژه _____________________________  
وضعيت موجودي: موجود است
تعداد:  
افزودن به ليست مقايسه | افزودن به محصولات مورد علاقه

تعداد صفحات : 59 صفحه _ فرمت WORD _ دانلود مطالب بلافاصله پس از پرداخت آنلاين

فصل دوم
هدف از اين تحقيق بررسي ايمني زايي ژنهاي L7/L12 و P39 در موشهاي Balac است. بنابراين پس از جداسازي و تكثير ژنهاي فوق مراحل زير در اين تحقيق انجام گرفت.
1- لكون نمودن ژنهاي فوق در يك ناقل انتقال دهنده Cleaning vector
2- تعيين ترادف نوكلئوتيدي ژنهاي جداشده و مقايسه آن با ژنهاي L7/L12
3- كلون نمودن ژنها در پلاسميد بيان كننده پروكاريوني Procaryotic expression vector
4- توليد و تخليص پروتئينهاي L7/L12 و P39
5- كلون نمودن آنها در پلاسميد بيان كننده اوكاريوتي Eucaryotic expression vector
6- هاري كردن پلاسميدهاي فوق از آندوتوكسين
7- تزريق پلاسميدها، بسويه واكنش و سويه بيماريزا بروسلاآبورتوس به موش Balb/C
8- سنجشهاي ايمونولوژيك
باكتريها و پلاسميدهايي كه براي انجام اين پايان نامه استفاده دشه اند بترتيب زير مي باشند:
باكتريها: بروسلاآبورتوس سويه هاي 19S و 544 اشديشيالكي سويه  
اشريشيالكي سويه BL21 – اشريشياكي سويه BL21(DE3(Plyss
پلاسميرها: PGEX4T1 – PRT 28a – SK+(pSK) - Pblue Script-PCDNA3
-    جداسازي كروموزوم بروسلا آبورتوس 19S:
براي تكثير ج داسازي ژنهاي L7/L12 و P39 ابتدا كروموزوم باكتري جداسازي گرديد.
مواد:
بافر TE:
Tris – Hel        10mm
EDTA        1.0mm
‍PH بافر را پس از تهيه برروي 8 تنظيم مي نمائيم.
پروتئيناز K:

CTAB/NaCl:
Nacl            4.1gr
CTAB        10gr
DDW            100ml (Final Volume)
روش:
ابتدا محيط برنسط برات را تهيه و استريل نموده و ml5 از محيط را با بروسط آبورتوس سويه 19S تلقيح مي نمائيم. پس 48 تا 72 ساعت باكتريها رشد كرده و كدورت مناسبي را پيدا مي كند. بقيه مراحل تخليص كروموزوم بشرح زير است:
1- 5/1 ميلي ليتر از سوسپاستيون فوق را مدت 2 دقيقه در rpm5000 سانتريفوژ مي نمائيم. محلول رويي را دور مي ريزيم.
2- Ml576 از بافر TE را بر روي رسوب باكتري اضافه كرده و رسوب را در بافر حل مي نمائيم. سپس ml30 از SDS(10%) و ml3 از پروئيناز K (mg/ml20) را افزوده و بمدت يكساعت در دماي 0C37 نگهداري مي نمائيم.
3- پس از مخلوز Ml100 از (M5)NaCl از محلول CTAB/NaCl بميزان Ml80 اضافه كرده و بمدت 10 دققيق در  0C65 انكوبه مي كنيم.
4- هم حجم مخلوط بالا از تركيب كلروفرم – ايزوآميل (1/24) به مخلوط افزوده و سپس از مخلوط بمدت 5 دقيقه در rpm10000 سانترفوژ مي كنيم. محلول رويي را به لوله ديگر منتقل مي نمائيم.
5- هم حجم محلول روئي ترميب فنل – كلروفرم – ايزوآميل (1/24/25) پس از مخلوط بمدت 5 دقيقه در vpr10000 سانتريفوژ كرده و محلول رويي به لوله ديگري منتقل مي نمائيم.
6- هم حجم محلول روئي ايزوپروپانل اضافه نموده و مخلوط مي كنيم. پس از چند دقيقه DNA كروموزومي ته نشين شده كه مي توان بات يك پيپت پاستور آنرا جمع آوري نمائيم.
7- رسوب DNA كروموزومي را با الكل 70% شستشو داده و پس از خشك شدن در مجاورت هوا در Ml100 از بافر TE حل مي نمائيم.
بررسي كمي و كيفي DNA كروموزومي:
براي تعيين خلوط كروموزوم باكتري از مواد و وسايل زير استفاده ميشود.
 
1- بافر PBE   pH=8(10X)
Tris – base                 890mM
Boric Acid                890mM
EDTA                25mM
2- آگارز MP
3- تانك الكتروفورز افقي
روش:
ابتدا آگارز MP در بافر TBE(0.5x) را بكمك حرارت حل كرده و ژل آگارز افقي را سيني مخصوص تانك الكتروفورز افقي تهيه مي نمائيم. سپس به مقدار Ml5 از DNA كروموزومي را در چلهك ژل ساخته شده ريخته و در تانك الكتروفورز حاوي بافر TBE(0.5x) پس از برقراري جريان الكتريكي مستقيم الكتروفورز مي كنيم.
بريا تعيين مقدار DNA نيز پس از تهيه رقت   تز كروموزوم DD آنرا در (Optimal Density) طول موج 260 نانومتر اندازه گيري مي نمائيم. مقدار DNA بر اساس فرمول:عكس رقت   50   DD قرائت شده = مقدار DNA تعيين مي گردد.
- مرحله پس از جداسازي كروموزوم تكثير و جداسازي ژنهاي مورد نظر است. اين فرآيند با استفاده از دستگاه PCR انجام مي گردد. در دستگاه PCR با استفاده از عوامل پايه اي، ژن مورد نظر را مي توان با استفاده از آنزيم تك پلي مرآز Tag Polymerase تكثير نمود. عوامل پايه اي ذكر شده شامل موارد ذيل است.
1- قالب
2- پرايمر جلو Forward
3- پرايمر عقب Revers
4- دروكسي نوكلئوتيدها LNTP
5- منيزيوم
6- بافر
7- آنزيم پلي مرآز
8- آب مقطر استريل
براي تهيه پرايمرها ابتدا بايد آنها را طراحي كرد. براي طراحي پرايمرهاي ژن L7/L12 و P39 ابتدا مترادف نوكلئوتيدي ژنهاي فوق را از مركز اطلاعاتي NCBI بدست مي آوريم.
accession No(L7/L12). L27819
accession No(P39). L35038
سپس بر اين اساس و درنظر گرفتن نكات استاندارد طراحي پرايمر از جمله طول پرايمر، دماي اتصال G+C%، توليد پرايمر، توليد لوپ يا حلقه و ... ترادف پرايمرهاي تعيين ميگردد. در اين مرحله از آناليزهاي كامپيوتري توسط برنامه Dlogo و Blast استفاده ميگردد.
ترادف ژن مورد نظر و پرايمرهاي Forward و Reverse براي جداسازي ژنهاي فوق از باكتري بروسلا به شرح زير است:

نظري براي اين محصول ثبت نشده است.


نوشتن نظر خودتان

براي نوشتن نظر وارد شويد.

محصولات
نظر سنجي
نظرتون در مورد ویکی پروژه چیه؟
  •   مراحل ثبت نام خیلی زیاده!
  •   مطلب درخواستیم رو نداشت!
  •   ایمیل نداشتم که ثبت نام کنم!
  •   مطلبی که میخواستم گرون بود!
نظرنتيجه